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2023-02-013410 次瀏覽
細胞凍存

實驗材料:

基礎(chǔ)培養(yǎng)基                          

血清(常規(guī)為FBS/NBS                           

無菌PBS磷酸鹽緩沖液                

電動移液槍

移液槍                              

超凈工作臺                             

無菌二甲基亞砜(DMSO

針式濾器 (0.22μm PES) [NEST]

杯式濾器(0.22μm PES) [NEST]

15mL、50mL無菌離心管[NEST]

程序降溫盒[NEST]

PET/PETG方形試劑瓶[NEST]

移液管[NEST]

自動旋蓋機[NEST]

盒裝無菌吸頭[NEST]

 

實驗準(zhǔn)備:

凍存液準(zhǔn)備:

一般的細胞:55%基礎(chǔ)培養(yǎng)基+40%牛血清(FBS/NBS+5%DMSO

重要的細胞:90%牛血清(FBS/NBS+10%DMSO

凍存液配置完成后,15ml離心管分裝,4℃條件下儲存?zhèn)溆?。若配置量較大,可分裝入50ml離心管,-20℃條件下冷凍儲存。(若牛血清內(nèi)存在析出沉淀物,采用0.22μm 濾膜過濾除菌)

使用前37℃水浴加熱

待凍存細胞:

使細胞凍存前,選擇細胞生長狀態(tài)良好,且處于對數(shù)生長期的細胞,凍存前12~24h換新鮮培養(yǎng)基維持細胞狀態(tài)。

實驗流程:

觀察待凍存細胞密度,約為80%~90%。用移液槍吸出陳舊培養(yǎng)基,加入無菌PBS清洗細胞1-2次,去除培養(yǎng)環(huán)境中的殘留培養(yǎng)基。

加入適量對應(yīng)胰酶或消化液,使胰酶沒過細胞,放入培養(yǎng)箱消化。顯微鏡下觀察細胞狀態(tài),胞質(zhì)回縮,細胞間不再連接成片,此時加入完終止液終止消化。

用吸頭輕輕吹打細胞,形成細胞懸液,將細胞懸液1000rpm,離心3-5min。丟棄上清,加入適量預(yù)先配制好的凍存液,輕輕吹打使細胞均勻并計數(shù)。用凍存液調(diào)節(jié)的細胞密度,使之終密度為5×106/ml1×107/ml。

用移液槍按照預(yù)計容量,分裝入細胞凍存管[NEST]中,采用自動旋蓋機[NEST]旋蓋密封。

標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序為降溫速率況處-1℃~-2/ min,可將待凍存細胞按照以下步驟逐步凍存:室溫→4℃(20min)→-20℃(30min)→-80℃(過夜)→液氮長期保存。

也可將待凍存放入程序降溫盒[NEST],直接-80℃過夜,再轉(zhuǎn)移至液氮保存。

 

使用到的NEST產(chǎn)品:

無菌二甲基亞砜(DMSO

針式濾器 (0.22μm PES) [NEST]

杯式濾器(0.22μm PES) [NEST]

15mL、50mL無菌離心管[NEST]

程序降溫盒[NEST]

PET/PETG方形試劑瓶[NEST]

移液管[NEST]

自動旋蓋機[NEST]

盒裝無菌吸頭[NEST]

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